纳米抗体结构分析l对缺失轻链的习惯

纳米抗体结构分析 l 对缺失轻链的习惯

#9998;1.前 言

与惯例抗体VH比较较，在FR2区域，VHH有四个氨基酸骤变，这是纳米抗体的特征。在惯例抗体中，这四个氨基酸残基参与了与VL的相互效果，同时与惯例抗体中所见的疏水相互效果位点比较，这些位点代替导致了VHH更高的亲水性。这一改变展现了VHH对其缺失轻链的习惯。研讨标明，该骤变不只对 VHH 的溶解度很重要，并且或许是 VHH 安稳性的关键决定因素。

2.1、VH与VHH之间的不同

VHH与VH比较较，最为显着的特征就是VH中的疏水残基被亲水残基所代替，这些被代替的残基本来参与了VH与VL的相互效果。VHH中亲水残基代替的区域咱们界说为;前;VH-VL效果界面。VHH为了习惯缺失轻链，得益于这些疏水残基被亲水残基所代替。

此外，VHH还有其他机制来习惯其单域结构状态。首先，VHH一般具有更长的CDR3。VHH第三个结合环扩大弥补了因缺失轻链形成的影响。一般状况下， VH中的三个CDR构成抗原结合区域，而VHH中更长的CDR3不只可以增大抗体和抗原触摸面，还可以使得其结合基序多样性更高。VHH中更长的CDR3还可以深入到酶的活性中心裂隙，然后更好地按捺或许调理酶的活性，而这是传统抗体难以做到的，传统抗体一般在 VH 和 VL 之间的结合空隙中结合抗原。

2.2、VHH结构域中的;前;VH-VL效果界面

在传统抗体中，VH-VL之间的相互效果仅限于一些氨基酸残基。一般来讲，在VH有10个残基与VL相互效果，分别是S/H35，V37，Q39，L45，W47，F/Y91，A/L93，X95，F/Y100和W103 。S/H35，V37，A/L93和 X95与VL效果弱乃至无效果。Q39, L45, W47, F/Y91, F/Y100以及W103同VL效果严密。大多数芳香族氨基酸残基构成疏水面，与VL发生疏水相互效果。

传统抗体的FR2中V37、G44、L45和W47这4个氨基酸残基是疏水性残基，在进化中是适当保存的。而VHH中，它们骤变为亲水性的氨基酸残基F37、E44、R45、G47，添加了VHH的溶解性，这一特征被认为是VHH的共同标志。而这些代替也发生在VH与VL相互效果的方位。VHH与VH比较较，其他一些本来VH与VL反生相互效果的方位也发生了氨基酸的代替。表1显现了在VHs中与VL相互效果的残基，以及它们在700个VHHs中的分布状况，其间11位氨基酸残基也被计算的原因是在VH中该氨基酸残基与CH1发生相互效果，而VHH中缺失CH1。43和46位氨基酸残基因为存在于VH-VL接口处，没有直接与VL相互效果而相同被列入表1中。VHH中最值得注意的还是四个氨基酸的代替，当然也有一些其他氨基酸，虽然没有四个氨基酸的代替那样保存，可是他们的代替相同也值得重视。而这些代替均主要是芳香族疏水性氨基酸残基被亲水性氨基酸残基所代替。

第11位的保存异亮氨酸是VH和 CH1之间的球窝连接的一部分。在骆驼VHH中，因为缺失CH1，第11位异亮氨酸极或许会因为疏水性质而发生骤变，而这一骤变确真实单峰骆驼(Dromedary)中被观察到(L11S)，这就说明第11位氨基酸残基被替换为更小更亲水的氨基酸残基，有助于VHH的溶解性添加。不过在大羊驼(Llama)中，虽然相同缺失CH1，可是这一替换是不保存的，在咱们的数据库中有84%的VHH第11为氨基酸为异亮氨酸。这说明在大羊驼(Llama)中L11发生骤变或许会对VHH结构发生影响，而单峰骆驼(Dromedary)或许克服这一问题。因而， L11在大羊驼(Llama)VHHs中的重要性是值得进行深入研讨的。

第35位氨基酸残基，虽然与 VL的触摸不是很严密，可是也坐落 VH-VL接口中。 研讨标明，第35位氨基酸残基主要由丝氨酸Ser或组氨酸His(人VH 中占21%)占有，并且在 97% 的状况下，定坐落抗原结合位点。在VHH中，该位点主要由丙氨酸Ala和甘氨酸Gly占有，标明该位点在VHH中的效果不同。在第27位和第29位引进两个体细胞骤变热点可以将CDR1从VHs中的31-35位残基扩大到VHHs中的27-35位残基。这种CDR1向N末端的延伸或许导致第35位氨基酸残基在抗原结合中的效果不太杰出。在VHH中第35位氨基酸残基或许在CDR1定向和连接两个beta;-折叠非常重要，G35的高频率呈现支持这一假设。

;邻近区;由界面中的氨基酸残基界说，这些氨基酸残基最接近抗原结合。第 35位和第95位氨基酸残基一般被认为是惯例抗体中;邻近区;中重要的氨基酸残基。这些氨基酸残基一般与抗原结合有关，因而像D95这样的亲水性较低的残基丰度很高。Gly，Tyr和Ser残基也经常呈现在第95位，这些残基或许是VH和VL之间构成疏水裂隙的原因。在美洲驼VHH中，第95位氨基酸残基也是高度可变的，但却是由带电的亲水性氨基酸残基占主导地位。这再次标明，虽然不那么显着，但这也是对于VHH对缺失VL作出的习惯。

相同，一般在VH和VHH中第93位氨基酸为丙氨酸Ala。但是，在VHH中，该方位也有24%的氨基酸为天冬酰胺Asn。虽然该位点的骤变不如其他位点那么显着，但这也使得VHH愈加亲水。

在VH改造为VHH过程中，发现V37F骤变对人VH热安稳有影响。Davies和Riechmann还认为对人VH的FR2骤变，会影响安稳性和表达量。在一系列独立的试验中，取得的结果标明，FR2的骤变对安稳性和表达量有影响。

表1 VHs和VHHs中在VH-VL界面氨基酸残基分布

氨基酸残基Q/E44是被认为是VHHs的标志的四个残基之一，与大多数VHs中的G44比较，归于结构性代替。在挑选识别Malasezzia furfar细胞外表蛋白的VHHs时，发现几个结合杰出的VHHs存在R44骤变。骤变Q44R导致VHHs在洗发水中的安稳性添加，而R44Q则显着下降VHHs在洗发水中的安稳性。此外，R44K并不影响在VHHs在洗发水中的结合，可是当pH值为11时，VHHs在洗发水中的结合才能削弱，因为K44的质子化程度较低。这标明，带正电荷的R44对VHHs在洗发水中的安稳性具有促进效果，电荷在VHH的这个区域很重要。

2.4、溶解度与安稳性

VHH1被证明可以在体外和体内按捺轮状病毒，为了提高中和轮状病毒的VHH的蛋白质溶解安稳性，进行了骤变挑选，。骤变体R27A显现出对胰蛋白酶的安稳性添加，热安稳性添加，产值水平添加，亲和力坚持不变。

别的两个骤变体是在;前;VH-VL效果界面上发生的。第一个骤变体R45A未表现出显着改变，其对胰蛋白酶敏感性不受影响，亲和力不受影响，表达水平略有下降，热安稳性略有下降。这标明虽然R45的保存率很高，到达97%，但某些骤变或许对VHH安稳性不会发生显着的影响。

氨基酸K43方位的骤变，也是高度保存的，占86%，确实对安稳性发生了巨大的影响。虽然T43存在于所有VHHs中的4%，但因为细胞内的堆集，K43T导致出产水平非常低。发生这种骤变体的酵母细胞的细胞内部分在考马斯亮蓝染色的凝胶上确实显现出VHH的堆集，但是，这种部分不能被纯化，或许是因为聚集。这标明排泄受到严峻阻碍，这或许是由不适当的折叠形成的。

图1 H14、R2和2个骤变体的Northern印迹。左上角是RNA凝胶电泳图；在右上方的旮旯是相应的Northern印迹；底部是体积计算和相对密度。

图1显现，与野生型H14比较，骤变体H14M的mRNA表达量下降了三倍，与野生型R2的mRNA水平比较，骤变体R2M下降了两倍多。作为对照试验，测定了针对Malf1的VHHs的mRNA水平。四个VHHs，两个含有T43R44(D12和A7M)，两个含有T43Q44(D12M和A7)，显现的mRNA数量大致相等(见图2)。这标明所做的骤变没有引起mRNA的急剧不安稳。

图2 D12、A7和2个骤变体的Northern印迹。左上角是RNA凝胶电泳图；在右上方的旮旯是相应的Northern印迹；底部是体积计算和相对密度。

虽然H14M和R2M的mRNA不安稳，但少数的骤变体VHH蛋白可以被纯化，并在洗发水中测试其安稳性。但这些骤变并没有导致VHH-R2和VHH-H14在洗发水中的结合力添加。，虽然这些残基已被证明对洗发水中的安稳性很重要，但它们并不是这种安稳性的仅有决定因素。

因为密码子的运用被证明对mRNA的安稳性有影响，或许是密码子的运用对这些骤变体不是最佳的。malf-D12运用的密码子是ACC，CGG(R)，而H14M和R2M运用的密码子是ACG和CGG(R)。因而，R44的密码子的运用不或许彻底导致mRNA的不安稳，虽然这个密码子是在酿酒酵母中最不常用的Arg密码子(1.7/1000)。在酿酒酵母中，Thr的密码子运用量为ACT(20.2)、ACA(17.7)、ACC(12.6)和ACG(8.0)。H14M和R2M的密码子运用状况与malf-D12的密码子运用状况比较，在酿酒酵母中的出产状况不那么理想。这或许是对mRNA安稳性下降的一个解释。但是，mRNA的安稳性很复杂，这或许不是不安稳的仅有原因。 为添加蛋白水解安稳性而构建的抗轮状病毒VHH1的骤变体K43T，也显现出蛋白出产水平的急剧下降。为了排除在H14和R2的骤变体中看到的mRNA安稳性的下降导致产值下降，咱们测定了mRNA的表达水平。图3显现了为下降胰蛋白酶敏感性的骤变挑选而发生的八个骤变体的Northern印迹。 图3显现骤变体K43T的mRNA没有显着下降。这标明排泄受阻是因为蛋白质水平的问题，并进一步支持这一骤变导致折叠问题的假设。

图3 VHH1骤变体的Northern印迹。左上角是RNA凝胶电泳图；在右上方的旮旯是相应的Northern印迹；底部是体积计算和相对密度。

#9998;3.小结

VH-VL界面相互效果的残基是高度保存的。这些残基一般是VH中大的、疏水的和芳香族的残基，具有与VL相互效果和构成结合裂隙的特殊功用。假如没有任何进一步的试验论证，人们或许很轻易地认为，在缺少VL的VHHs中，这些残基的重要性较低，保存性也较低。但是VHHs中的这些残基具有更高的可变性，这些残基的重要性表现在经过将疏水残基替换成更亲水和常带电荷的残基。

疏水残基到亲水残基代替的一个特殊破例是W103。这个大芳香族分子和非常疏水性的残基在96%的VHHs中也可以看到。这意味着W103在VHHs中的效果与 quot;前 quot;VH-VL界面中的其他残基不同。

从VH到VHH观察到的替换显着添加了亲水性。在这里，咱们为 quot;前 quot;VH-VL界面中的残基的更广泛的功用提供了依据这些残基，特别是亲水的KEREF/L延伸部分的残基是决定VHHs安稳性的关键因素。对残基分布的研讨显现，该区域的代替率最高。此外，第43、44和第45位的骤变对安稳性有极大的影响。这标明，这些残基在VHHs的安稳性中具有关键效果。